Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen






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Arbeitsblatt
  1. Beschreiben Sie den Aufbau eines DNA-Moleküls.
    DNA besteht aus zwei Nucleotidketten. Jedes Nucleotid setzt sich aus einem Zucker (Desoxyribose), einer Base (es gibt vier Basen: Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin, oft A, T, G und C genannt) und einer Phosphatgruppe zusammen. Die beiden Stränge sind in der DNA antiparallel angeordnet und werden von Wasserstoffbrücken zusammengehalten. Diese Bindungen bilden sich zwischen komplementären Basen: Adenin paart sich immer mit Thymin und Cytosin mit Guanin.

  2. Vergleichen Sie die Spaltung von DNA durch die Restriktionsenzyme EcoRI, PstI und SmaI.
    EcoRI spaltet so, dass einige Basen ungepaart bleiben - oft spricht man auch von „klebrigen Enden“. PstI schneidet die DNA ganz ähnlich, nur von der anderen Seite. SmaI bringt den Schnitt so an, dass keine ungepaarten Basen verbleiben: Es erzeugt „glatte Enden“. Alle diese Enzyme schneiden nur dann, wenn sie eine bestimmte Sequenz in der DNA erkennen.

  3. Welches Ausgangsmaterial braucht man für die meisten Restriktionsspaltungen?
    Normalerweise läßt man die Reaktion in einem Volumen von 20 Mikrolitern ablaufen. Das Gemisch enthält
      DNA (meist 1 Mikrogramm oder weniger)
      Puffer
      Wasser
      Restriktionsenzym
      Meist läßt man die Reaktion eine Stunde bei 37oC laufen; anschließend wird die gespaltene DNA analysiert oder in anderen Reaktionen (zum Beispiel Klonierung) weiter verwendet.

  4. Zu welchem Pol wandern die DNA-Fragmente in der Elektrophorese? Was besagt das über die DNA-Fragmente?
    Die DNA-Fragmente wandern in einer Elektrophoresekammer zum positiven Pol. Es handelt sich also bei den DNA-Fragmenten um negativ geladene organische Moleküle.

  5. Nennen Sie die sechs Schritte der Elektrophorese.
    1. Gel aufbauen
    2. Elektrophoreseapparat aufbauen
    3. Gel mit der DNA beladen
    4. Wanderung der DNA-Fragmente (Strom einschalten)
    5. Färben der DNA-Banden
    6. Ergebnisse fotografieren und festhalten

  6. Wozu erstellt man eine Eichkurve?
    Um die Größe unbekannter DNA-Fragmente zu ermitteln, erstellt man zunächst mit Marker-DNA eine Eichkurve mit log(bp) auf der y- und der Wanderungsstrecke auf der x-Achse. Man sollte daran denken, dass die genaue Wanderungssstrecke der DNA-Fragmente von Experiment zu Experiment unterschiedlich sein kann.

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