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Wie man folgendes macht:
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| Identifizierung einer unbekannten cDNA-Sequenz
Sie erhalten eine Textdatei mit einer cDNA-Sequenz ("DNA-Sequenz.txt"). Ihre erste Aufgabe ist es, herauszufinden, für welches Protein diese cDNA codiert. Dafür durchsuchen Sie die im WWW vorhandenen Datenbanken mit dem BLAST-Algorithmus:
BLAST(via NCBI-Server) Durchsuchen Sie die Proteindatenbanken mit der Ihnen vorgegebenen cDNA-Sequenz. Dazu öffnen Sie die Textdatei mit der Sequenz mit einem Editor und kopieren Sie diese in die entsprechende Dialogbox. Dazu müssen Sie die Option "blastx" auswählen. Um welches Protein welcher Organismenart handelt es sich? Mit welchen anderen Proteinen weist diese Sequenz Ähnlichkeiten auf? Translation der cDNA in eine Proteinsequenz Alle weiteren Analysen werden mit der aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz durchgeführt. Dazu müssen Sie die vorgegebene Nucleotidsequenz in die Aminosäuresequenz mit Hilfe von ExPASy Server übersetzen. Kopieren Sie die DNA-Sequenz wiederum in die dafür vorgesehene Dialogbox und wählen Sie unter der Option "Output format" "Compact ("M","-", no spaces)" und starten Sie das Programm ("Translate Sequence"). Nun erhalten Sie die in allen sechs möglichen Leserastern translatierte DNA-Sequenz. Wählen Sie das geeignete Leseraster. Woran erkennen Sie, welches Leseraster das richtige ist? Das so erhaltene Protein kopieren Sie und speichern es ab (ohne das Starter-Methionin). Es wird im Folgenden für alle weiteren Analysen benötigt. Erstellen eines Mehrfach-Sequenzvergleichs (Multiple sequence alignment) Um zu phylogenetischen Aussagen zu kommen, müssen Sie geeignete Vergleichssequenzen auswählen. Dazu können Sie wiederum mit den BLAST-Programmen die Proteindatenbanken durchsuchen (diesmal Option "blastp", d.h. Vergleich eines Proteins mit anderen Proteinen):
BLAST(via NCBI-Server) Wir habe für Sie bereits eine Vorauswahl von elf geeigneten „orthologen“ Sequenzen getroffen (d.h. von dem entsprechenden Protein aus verschiedenen Organismenarten). Diese finden Sie im sogenannten "PIR"-Format vorgegeben. Öffnen oder kopieren Sie diese Datei ("Proteine.pir") mit einem Texteditor (z.B. WordPad) und fügen Sie Ihre Proteinsequenz hinzu: >Artname VLSAADKT......usw. Nach dem Abspeichern (als Textdatei: .txt) öffnen Sie das Programm "ClustalX" und laden die Datei " Was erkennen Sie an diesem Alignment? Was hat das Programm mit den Sequenzen, im Vergleich zu den Ausgangsdaten, gemacht? Molekulare Stammbaumanalyse ist auch in der Lage, einfache molekularphylogenetische Analysen (im sog. "Neighbor-joining"-Verfahren) durchzuführen. Für genauere Untersuchungen sind im Internet weitere Programmpakete frei erhältlich: z.B. PHYLIP. Zur Analyse mit ClustaX gehen Sie nun zum Menü "Trees" und starten Sie unter "Draw N-J Tree" die phylogenetische Analys. Bestätigen Sie dies in der Dialogbox ("OK"). Sie erhalten einen Stammbaum, welcher unter "
Nun starten Sie das Programm "TreeView" und öffnen Sie die Stammbaumdatei (Menü "File" -> "Open"). Um einen phylogenetisch aussagekräftigen Stammbaum zu erhalten, müssen Sie zunächst eine Außengruppe bestimmen. Unter Außengruppe (outgroup) versteht man die Sequenzen derjenigen Spezies, die sich im Verlauf der Evolution als erste abgespalten haben. Da die zu untersuchenden Sequenzen ausschließlich Wirbeltiere umfassen, sind hier die Sequenzen der Fische als Außengruppe zu definieren. Unter dem Menü "Tree" finden Sie die Option "Define outgroup". Durch Doppelklick wählen Sie die beiden Fischsequenzen (Lachs und Zebrafisch) aus, welche sich anschließend in der rechten Box befinden. Bestätigen Sie ("OK"). Anschließen wählen Sie wiederum das Menü "Tree", und wählen Sie die Option "Root with outgroup". Nun erhalten Sie einen auf Basis des zunächst ausgewählten Proteins einen Stammbaum der Wirbeltiere. Was fällt Ihnen auf? Beachten Sie insbesondere die relative Position der Reptilien und Vögel! |